多年生化、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究成果已經(jīng)使得酵母菌成為一種的基因表達(dá)研究和蛋白質(zhì)重組表達(dá)的通用宿主，成為生物系統(tǒng)研究的模式型生物，是生物制藥科學(xué)家的有力工具。盡管包括Pichia、Hansenula、Debaryomyces均被研究者所使用，但使用zui普遍的依然是Saccharomyces酵母。

酵母菌mRNA 和細(xì)胞內(nèi)蛋白，很難用傳統(tǒng)酶解方法完整提取。裂解酶中通常含有核糖核酸酶和其他蛋白酶，它們不僅會(huì)破壞細(xì)胞壁，且會(huì)破壞特定分子。另外，酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體，需借助特定試劑進(jìn)行溶解，而導(dǎo)致很多蛋白質(zhì)變性失活。因此常常需要使用物理方法破碎酵母菌，從而釋放內(nèi)容物。

通常的壓榨或球磨方式，每次只能處理一個(gè)樣品，操作效率太低。對(duì)于那些需要進(jìn)行高通量篩選檢測(cè)酵母菌的實(shí)驗(yàn)，單個(gè)處理是一個(gè)主要的瓶頸和不切實(shí)際的，所以我們就需要一種可以單次高通量裂解細(xì)胞的方法。Geno/Grinder組織研磨儀——一個(gè)zui初是為了在深孔板中高通量破碎種子而設(shè)計(jì)的垂直振蕩研磨儀就可以很好的解決這一問(wèn)題。可同時(shí)在6個(gè)96孔深孔板中對(duì)酵母菌進(jìn)行破碎。實(shí)現(xiàn)高通量地裂解酵母。

材料和方法：

釀酒酵母在YPD培養(yǎng)基（(1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖)）中30°C下150 rpm振蕩培養(yǎng)一整夜，使用無(wú)菌96孔板（CorningLife Science），每個(gè)孔中加入100 ml 培養(yǎng)液和酸洗的玻璃珠(Sigma,G-8772)。使用一系列不同尺寸的玻璃研磨珠（106 目 (非常小),150-212 目,212-300 目,425-600 目(大).）對(duì)照組酵母菌中只加入培養(yǎng)液不加玻璃研磨珠。蓋上橡膠密封墊密封后放入Geno/Grinder動(dòng)植物組織研磨機(jī)內(nèi)，固定好。 1500轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩5-10分鐘。完成后，用相差顯微鏡檢查酵母培養(yǎng)物并拍照。

結(jié)果和討論：

酵母裂解的有效性取決于玻璃珠的大小和研磨持續(xù)的時(shí)間。圖1-3是用425-600目玻璃珠振蕩5-10分鐘的細(xì)胞裂解的效果。在裂解細(xì)胞時(shí)，玻璃珠的目數(shù)越低效果更差，106目的玻璃珠尤其沒(méi)有效果。結(jié)果表明425-600目的玻璃珠是裂解Saccharomyces的。

Geno/Grinder組織研磨儀的*設(shè)計(jì)也是裂解過(guò)程中一個(gè)重要的因素。標(biāo)準(zhǔn)的珠磨研磨機(jī)適應(yīng)微孔板的應(yīng)用模仿“油漆攪拌器”設(shè)計(jì)，呈8字形運(yùn)動(dòng)。這種運(yùn)動(dòng)方式不能使樣品得以均一的裂解，樣品間差別很大。而Geno/Grinder的垂直振蕩模式則能有效的裂解多孔材料中的樣品，這種上下垂直運(yùn)動(dòng)方式使得玻璃珠更直接的碰撞細(xì)胞（而不會(huì)像一般的珠磨除了碰撞細(xì)胞外也常常會(huì)碰撞孔壁），從而能夠得到均一的研磨效果。

圖1. 對(duì)照組未加玻璃珠的酵母菌。10分鐘后，這些酵母菌依然完好無(wú)損。

圖2. 用425-600目玻璃珠振蕩5分鐘的細(xì)胞裂解的效果。破碎的酵母像是黑暗的“鬼魂”，完整的酵母菌則繼續(xù)折射光而呈現(xiàn)出明亮的部分。

圖3. 用425-600目玻璃珠振蕩10分鐘的細(xì)胞裂解的效果。絕大多數(shù)酵母菌已經(jīng)破碎呈現(xiàn)出黑暗的細(xì)胞“鬼魂”陰影，極少幾個(gè)酵母菌沒(méi)有被振蕩破碎而呈現(xiàn)出明亮的部分。

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